EU-Click新生RNA捕获试剂盒

【产品组分】

*Wash Buffer稀释：可用DEPC水。

**此处提供的EU用量以T25培养瓶培养细胞的需求量为准，若需要更多的EU试剂，可单独购买。

【运输与存储】

【产品优势】

•动态监测RNA合成、降解全过程，挖掘静态测序找不到的基因调控新机制；

•精准建模刺激条件下转录、降解双重调控的RNA动态变化，量化双向调控贡献；

•分离新生RNA信号，降低背景干扰，低丰度应答基因也能精准识别，提升差异分析精度；

•摒弃复杂Pull-down富集步骤，操作简单省时，减少人工操作误差；

•温和标记无细胞毒性，不干扰细胞原有生理转录状态，数据更贴近体内真实情况；

•适配活细胞、活体动物、植物等多类活体样本；

•捕获产物直接兼容建库、测序、qPCR等下游实验，一站式完成转录动力学研究；

•标记效率稳定，适合大批量时间梯度动力学样本检测。

【注意事项】

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩及一次性手套，在洁净实验区域内进行实验操作，且使用无RNA酶的试剂与耗材；

2. 试剂盒的各个组分，在使用前需完全解冻并充分混匀，试剂待用期间需放置于冰上。

【自备材料】

1. RNA提取：Trizol或RNA提取试剂盒等相关试剂；

2. RNA质控：Nanodrop、Qubit荧光计、Agilent 2100 Bioanalyzer或其他等效产品；

3. 其他：磷酸盐缓冲液、无水乙醇、无菌超纯水、无菌无酶水，低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

【实验流程】

EU-Click新生RNA捕获试剂盒实验流程示意图

【操作步骤】

一、EU孵育（下述分别以细胞、动物、植物样本为例进行EU孵育浓度与时间的探讨，若涉及其他样本，请参考文献资料或过往的实验数据）

1.1 细胞样本

细胞密度在70%-90%或细胞密度达到实验设计的需求，可进行EU孵育。为保证较好的实验结果，一般建议进行新生RNA捕获的细胞量不低于1×10⁶。

用完全培养基稀释EU至合适浓度，并用含有EU的完全培养基培养细胞（对细胞样本，常见的EU使用终浓度为1 mM），孵育2小时。针对不同细胞及不同的实验目的，可参考相关文献报道，以调整合适的EU孵育浓度及时间。

初次实验时，可按照下述推荐EU终浓度和孵育时间进行预实验。

1.2 活体动物

用PBS配制一定浓度的EU溶液，按照200-400 mg/kg的用量，根据动物体体重进行注射或灌胃。具体EU用量与实验动物的种类、体重以及使用方式有关，需参考相关文献。初次使用时建议对EU的使用浓度进行摸索，若无相关参考文献，可使用200 mg/kg的浓度进行测试，4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死实验动物（如小鼠），取出所需组织，进行后续实验。

1.3 植物样本

根据植物体的培养环境添加EU进行孵育，用量可参考相关文献，对于液培样本，可以在培养基中加入EU使其终浓度为0.5 mM，培养6-8小时。

二、RNA提取（下述以Trizol方法为例，亦可使用RNA提取试剂盒进行提取）

2.1 对于培养的细胞样本，去掉培养基，用1 mL Trizol将细胞裂解，置于无酶离心管中，室温静置5 min；对于植物以及动物样本，用无酶PBS清洗组织样本2-3次，置于1 mL Trizol中，使用研磨仪研磨直至看不到组织块，后置于无酶离心管中，室温静置5 min；

2.2 加入200 μL氯仿，涡旋混匀，室温静置3 min；

2.3 14000g 离心5 min，取上清，加入等体积异丙醇，涡旋混匀；

2.4 冰上静置10 min，14000g离心20 min，弃上清；

2.5 用75%的乙醇清洗沉淀，14000g离心5 min；

2.6 重复步骤2.5；

2.7 弃上清，待乙醇挥发后，加入50 μL DEPC水溶解RNA。

三、点击化学反应

3.1 点击化学反应液的配制（需现用现配）

3.2 向2.7步骤中得到50 μL DEPC水溶解RNA中加入150 μL点击化学反应液，涡旋混匀；

3.3 冰上静置30 min；

3.4 向3.3步骤的反应液中加入1 mL Trizol，涡旋混匀；重复2.2-2.6步骤中RNA提取的过程，弃上清且待乙醇挥发后，加入50 μL DEPC水溶解RNA。

四、链霉亲和素磁珠（SMB）的准备

4.1 将链霉亲和素磁珠涡旋振荡以使其充分悬浮，注意不要离心，以防磁珠沉降；

4.2 磁珠用量：20 μL链霉亲和素磁珠/样品。对于多个样品（n），可一次洗性吸取n×20 μL的链霉亲和素磁珠至一个离心管中。加入1倍体积的2×Wash Buffer（n×20 μL），混匀后置于水平旋转仪上，低速旋转1 min，后置于磁力架上，待磁珠吸附完成后，弃上清；

备注：

1、使用水平旋转仪的目的在于防止磁珠的自然沉降，亦可使用具有相同功能的仪器以让磁珠保持混匀；

2、因不同磁力架磁力大小不同，磁珠吸附时间会有所差别。一般情况下1-3min，至磁珠完全吸附于离心管侧壁并至溶液澄清后即可。

4.3 向装有磁珠的离心管中加入2倍体积的2×Wash Buffer（2×n×20 μL），混匀后置于水平旋转仪上，低速旋转1 min后，后置于磁力架上，待磁珠吸附完成后，弃上清；

4.4 向装有磁珠的离心管中加入2倍体积的溶液A（2×n×20 μL），混匀后置于水平旋转仪上，低速旋转1 min后，置于磁力架上，待磁珠吸附完成后，弃上清；

4.5 重复4.4步骤；

4.6 向装有磁珠的离心管中加入2倍体积的溶液B（2×n×20 μL），混匀后置于水平旋转仪上，低速旋转1 min后，置于磁力架上，待磁珠吸附完成后，弃上清；

4.7 重复4.6步骤；

4.8向装有磁珠的离心管中加入2.5倍体积的2×Wash Buffer（2.5×n×20 μL）重悬。

五、新生RNA捕获

5.1向第三步中得到的RNA样本中，每个样本加入50 μL准备好的链霉亲和素磁珠；

5.2涡旋混匀后室温孵育20 min，将离心管置于磁力架中2-3 min，待磁珠吸附完成后，弃上清；

5.3每个样本加入20 μL 的1×Wash Buffer，混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；再重复2次。此时新生RNA已经被链霉亲和素磁珠捕获，通过本试剂盒捕获的新生RNA可用于RT-qPCR，RNA-seq等下游实验。