EU-Click新生RNA成像试剂盒

【产品组分】

**此处提供的EU用量以6孔培养本培养细胞的需求量为准，若需要更多的EU试剂，可单独购买。

【运输与存储】

【注意事项】

1. 实验过程中请穿戴实验服、口罩及一次性手套，在洁净实验区域内进行实验操作，且使用无RNA酶的试剂与耗材；

2. 试剂盒的各个组分，在使用前需完全解冻并充分混匀，试剂待用期间需放置于冰上。

【自备材料】

4%多聚甲醛固定液、BSA、PBS、Triton X-100、Hoechst 33342或DAPI

【操作步骤】

一、EU孵育及样本处理

1.1细胞的EU标记及处理

• 本实验方案以六孔板或激光共聚焦皿为例进行实验；如使用其他培养器皿，检测体系应按比例缩小或扩大。悬浮细胞请按常规的悬浮细胞的操作方式进行，相关步骤需要增加离心步骤等。
• 根据实验需求，在培养器皿中传入适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后，进行所需的药物处理或者其它刺激处理等。
• 使用完全培养基稀释EU，并用稀释后达到合适EU浓度的完全培养基培养细胞（常见细胞EU的使用终浓度为1 mM），孵育2小时。针对不同细胞及不同的实验目的，建议参考相关文献报道，调整合适的EU终浓度以及孵育时间。
• 细胞完成标记后，去除培养液，加入1mL固定液，室温固定15分钟。
• 去除固定液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞3次，每次3-5分钟。
• 去除洗涤液，每孔用1mL通透液，室温孵育10-15分钟。
• 去除通透液，每孔用1mL洗涤液洗涤细胞1-2次，每次3-5分钟。

转至进行步骤2点击反应（短时间内可放在室温，若长时间较长，需放4℃保存）。

1.2动物的EU标记及处理

根据动物体体重进行注射或灌胃，可以按照200-400 mg/kg的用量，把EU用PBS配制成一定浓度，进行注射或灌胃。具体用量与所用动物的种类、体重以及使用方式有关，可以参考相关文献，如初次使用时建议对EU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用200 mg/kg的浓度进行测试，4小时后或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织。根据需求按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。

• 冰冻切片：

(a)加入适量*固定液，室温固定15分钟。

(b)去除固定液，用适量*洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。

(c)去除洗涤液，用适量*通透液，室温孵育10-15分钟。

(d)去除通透液，用适量*洗涤液洗涤1-2次，每次3-5分钟。

(e)抗原修复（选做）：如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色，并有必要进行抗原修复，可以使用适当的抗原修复液。

转至进行步骤2点击反应（短时间内可放在室温，若长时间较长，需放4℃保存）。

*根据切片大小滴加液体，需要将切片全部覆盖。

• 石蜡切片：

(a)脱蜡：二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟，换新的无水乙醇3分钟。95%乙醇3分钟。85%乙醇3分钟。75%乙醇3分钟。50%乙醇3分钟。PBS 5分钟。

(b)抗原修复（选做）：如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色，可以使用适当的抗原修复液。

转至进行步骤2点击反应（短时间内可放在室温，若长时间较长，需放4℃保存）。

注：以上步骤可以根据自己的实验要求进行改变或者按照自己实验步骤进行。

二、点击反应

1. 配制点击反应液（详见产品说明书）
2. 去除上一步骤中的洗涤液或抗原修复液等液体。
3. 加入适量点击反应液（对六孔板或激光共聚焦皿，每孔加入5mL点击反应液；对于冰冻切片或石蜡切片，所滴加液体需将切片全部覆盖），轻轻摇晃培养器皿或切片以确保反应液可以均匀覆盖样品。
4. 室温避光孵育30分钟。
5. 吸除点击反应液，用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
6. 如需对细胞核进行染色，可以参照步骤3进行。如无其它的特殊需要，即可在荧光显微镜下观察，或者使用流式细胞仪、多功能酶标仪进行荧光检测。Azide 594的最大激发波长是590nm，最大发射波长是615nm。

三、细胞核染色（选做）

1. 为了定位细胞核检测细胞增殖的比例，可以使用Hoechst 33342或者DAPI进行细胞核染色。
2. 接步骤点击反应步骤中的第5步，吸除洗涤液后，每孔加1×Hoechst 33342或1×DAPI溶液0.5-1mL，室温避光孵育10分钟。
3. 吸除细胞核染色溶液。
4. 使用洗涤液洗涤3次，每次3-5分钟。
5. 随后即可进行荧光检测；Hoechst 33342或DAPI为蓝色荧光。

四、成像检测

对以上步骤获得的细胞或组织切片样本，选择合适的仪器进行成像检测。