产品简介

本试剂盒使用5-乙炔基尿嘧（EU）标记活细胞中的新生RNA，然后通过点击化学反应，使新生的RNA标记上生物素，再通过链霉亲和素磁珠特异性捕获新生的RNA，捕获的新生的RNA可用于后续的qPCR、RNA测序等应用。结合实验时间设计，能够对新生成的RNA进行定量分析，同时能够研究RNA转录水平和降解问题。

产品特点

l 可进行转录组--RNA合成及降解的动力学分析；

l 获取控制基因表达的新见解；

l 建立刺激诱导的RNA转录和降解之间序列改变的模型；

l 通过比较新生转录水平，显著提高差异表达的分辨率；

l 操作简单，无需繁琐的Pull-down实验；

l 适用于活体动物、植物以及活细胞样本。

储存及运输条件

试剂盒1：2~8℃存储，冰袋运输；试剂盒2：-25~ -15℃保存，≤ 0℃运输。

注意事项

实验过程中，请穿实验服并佩戴口罩和一次性手套，在洁净实验区域内操作，同时注意使用无RNA酶的耗材；

试剂盒使用前需完全解冻并混匀后使用，待用期间请将试剂放于冰上；

本产品仅作科研用。

材料准备（试剂盒中不提供）

1. RNA提取试剂盒，TRIZOL，异丙醇；

2. RNA质控：Nanodrop、Agilent 2100 Bioanalyzer或其他等效产品；

3. 其他材料：磷酸盐缓冲液、无水乙醇、无菌超纯水、无菌无酶水，低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

实验流程

Fig.1 STAR-Click新生转录本捕获试剂盒流程示意图。

操作步骤

1 培养及RNA提取

1. EU孵育（不同样本选取不同条件）

1.1 细胞样本EU孵育

细胞密度在70-90%或细胞密度达到实验设计的需求，进行EU孵育。使用完全培养基进行稀释EU，常见细胞EU的使用终浓度为1 mM，孵育2小时。或根据文献报道，也可调整EU终浓度以及孵育时间。初次实验，可按照推荐EU剂量和时间进行预实验；如T25瓶的细胞将其培养基去除后，将配置好的含有1 mM EU培养基加入到培养瓶中进行孵育2小时*。按照步骤2进行后续实验。

下表为推荐测试的EU剂量和时间：

*肺癌细胞（95D、H1573、H209、H226、H292、H460）、肝癌细胞（HepG2、Huh7、SMMC-7721B、Hep3B、PLC/PRF/5、SK-HEP-1、BEL-7402、Mahlavu、Focus）、乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1937、SUM149、MCF-7、T47D、CAMA-1、ZR-75-1、HCC1954、SK-BR-3、Hs578T、BT-594）、卵巢癌细胞（A2780、SKOV3、ES2、HEY、CAOV3、OVCAR8、Anglne、UWB1.289）、宫颈癌细胞（HeLa、SiHa、CaSki、C-33A、ME-180、HT-3、MS751、DoTc2 451、SW756、ME-180）、胃癌细胞（AGS、MKN-45、MKN-28、NCI-N87、SNU-1、HGC-27、NUGC-3、OCUM-1）、结直肠癌（HCT-116、HT-29、SW480、SW620、Caco-2、LoVo、DLD-1、COLO 205、RKO、LS 174T、LS 180、T84）、肾癌细胞（786-O、Caki-1、Caki-2、ACHN、769-P、A498、OS-RC-2）、神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y、SK-N-SH、IMR-32、LAN-1）、成骨细胞（SJSA-1、TE-85）、神经细胞（U87、NSC-13、U251、PC12）等常见的癌症细胞和非癌症细胞。

1.2 动物组织EU孵育

根据动物体体重进行注射或灌胃，可以按照200-400 mg/kg的用量，把EU用PBS配制成一定浓度，进行注射或灌胃。具体用量与所用动物的种类、体重以及使用方式有关，可以参考相关文献，如初次使用时建议对EU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用200 mg/kg的浓度进行测试，4小时后*或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织。按照1中步骤2进行后续实验。

*实验验证过小鼠、大鼠、黄鼠、兔子等常见动物模型。

1.3 植物样本EU孵育

根据植物体的培养环境进行添加EU进行孵育，用量可以参考相关文献进行，对于液培可以在培养基中加入EU使其终浓度为0.5 mM，培养6-8小时*，可根据自己方法提取RNA，提取完RNA后，进行第2步点击反应后续实验。

*实验验证过水培和土培的人参、多种花卉和粮食作物等。

2 RNA提取

2.1 对于培养的细胞样本，去掉培养基，用1 ml TRIZOL将细胞裂解，置于无酶EP管中，室温静置5 min；对于植物以及动物样本，取到相应组织后，用无酶PBS清洗组织2-3次，将其置于1 mL TRIZOL中使用研磨仪器研磨直至看不到组织块，置于无酶EP管中，室温静置5 min；

2.2 加入200 μL氯仿，涡旋混匀，室温静置3 min；

2.3 14000g 离心5 min，取上清，加入等体积异丙醇，涡旋混匀；

2.4 冰上静置10 min，14000g离心20 min，弃上清；

2.5 用75%的乙醇清洗沉淀，14000g离心5 min；

2.6 重复步骤2.5；

2.7 弃上清，待乙醇挥发后，加入50 μL DEPC水溶解RNA。

2.8 rRNA去除，推荐启衡星核糖体RNA去除试剂盒进行rRNA的去除（这一步为推荐选项，rRNA去除可以提高目标RNA的检测灵敏度以及减少测序量）。

3点击反应

3.1 点击反应液配制

3.2 每个样本中加入150 μL点击反应液，涡旋混匀；

3.3 冰上静置30 min；

3.4 向点击反应液中加入1 ml TRIZOL，涡旋混匀；

3.5 重复RNA提取过程（TRIZOL法提取）。

4准备链霉亲和素磁珠（SMB）

4.1 涡旋振荡使链霉亲和素磁珠充分悬浮，不要离心，以防磁珠沉降；

4.2 每个样品取20 μL重悬好的磁珠到一个新的EP管中。对于多个样品所需SMB磁珠的清洗，可一起进行，如将6 个(120 μL)或12个样品(240 μL)的磁珠分装在一个管中进行清洗。每20 μL链霉亲和素磁珠加入20 μL的2×Wash Buffer混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；

4.3 取下装有磁珠的EP管后，每20 μL链霉亲和素磁珠加入40 μL的2×Wash Buffer混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；

4.4 同步骤4.2操作，每20 μL链霉亲和素磁珠使用40 μL溶液A清洗2次，接着使用40 μL溶液B清洗2次；

4.5弃上清后，向磁珠（每个样）中加入50 μL的2×Wash Buffer重悬；

5新生RNA捕获

5.1向第3步中得到的RNA，每个样本加入50 μL准备好的链霉亲和素磁珠；

5.2涡旋混匀后，室温孵育20 min，将EP管置于磁力架中2-3 min，待磁珠吸附完成后，弃上清；

5.3每个样本加入20 μL 的1×Wash Buffer，混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；再重复2次。

5.4 此时新生RNA已经被链霉亲和素磁珠捕获，此时捕获的新生RNA可以用于下游的应用，如RT-qPCR，RNA-seq等。