信噪比提升N个数量级！CUT&Tag：一款让基因组数据“背景”消失的神器
什么是CUT&Tag？
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）是一种主要用于研究蛋白质（如转录因子、组蛋白修饰等）与DNA相互作用的高通量测序技术。
我们可以把它理解为一个在细胞核内进行的“精准定位剪切”技术，其核心工作原理类似于“分子特洛伊木马”。
进入城堡：首先，保持细胞核的完整。用一种叫做洋地黄皂苷（Digitonin） 的试剂在细胞膜上打孔（通透），使得抗体能够进入细胞核，但核膜保持基本完整。
找到目标：加入一抗（Primary Antibody），这个抗体会特异性地结合到我们感兴趣的目标蛋白上（例如，结合在H3K27me3组蛋白上的抗体）。
引入“木马”：加入二抗（Secondary Antibody），这个二抗既能结合一抗，又能招募一个特殊的工程酶——pA-Tn5转座酶。pA是蛋白A，能强力结合抗体的Fc片段；Tn5是一个转座酶，能切割DNA并加上测序接头。此时，这个pA-Tn5复合物就像被抗体“导航”一样，被精确地带到了目标蛋白所在的基因组位置。
内部爆破：通过加入Mg²⁺来激活Tn5转座酶。被激活的Tn5会在被锚定的位置附近，对周围的DNA进行切割（Cleavage），同时在切割的断口上直接加上测序接头（Tagmentation）。
收集情报：将DNA从细胞核中释放出来，这些带接头的DNA片段就是目标蛋白曾经结合过的DNA区域。然后通过PCR扩增这些带接头的片段，构建成文库，进行高通量测序。
信息输出：通过测序分析，我们就可以得到一张全基因组范围内，目标蛋白（如转录因子、组蛋白修饰）在DNA上的结合位点图谱。
与同类技术对比的优劣势
CUT&Tag最主要的对比对象是它的前身技术 ChIP-seq（染色质免疫沉淀测序），以及另一个改进技术 ATAC-seq（主要研究染色质开放性）。此外，随着技术的发展，目前还有DAP-seq和Hi-CUT等不同的技术形式。
CUT&Tag实验成功的关键因素
要想做好CUT&Tag实验，除了选用优质的CUT&Tag建库试剂盒（比如，FS-L1005，
StarLighter CuT&Tag 快速建库试剂盒 V1）外，还要注意实验操作上的各种关键因素。
细胞质量与数量
l 活性：使用生长状态良好、活性高（>90%）的细胞。死细胞会增加背景噪音。
l 数量：标准方案通常从100 -1,000,000个细胞开始。细胞量过少会导致文库复杂度低；过多则可能使通透化和洗涤不充分。
l 单细胞悬液：实验前必须将细胞吹打成单细胞悬液，任何细胞团块都会导致实验失败。
细胞通透性
l目的：让抗体和酶顺利进入细胞核，结合到目标染色质上。
l 通透不足：抗体和酶无法进入，导致信号微弱或无信号。
l 通透过度：细胞核结构被破坏，导致背景信号增高，甚至细胞核碎裂。理想状态是在显微镜下看到细胞形态完整但细胞膜被穿孔。
l 优化：必须针对不同细胞类型（尤其是原代细胞或组织）优化Digitonin的浓度和作用时间。
抗体质量与用量
l特异性：必须使用经过验证的高特异性、高效价的一抗。抗体的好坏直接决定了实验的成败。建议使用ChIP或IF验证过的抗体。
l 用量：抗体过量可能导致脱靶结合，增加背景；用量不足则导致信号弱。需要进行抗体滴定实验来优化。
结合与洗涤条件
l 温度与时间：一抗、二抗和pA-Tn5转座酶的结合需要在温和的摇床或旋转仪上进行，确保充分结合且细胞不结块。
l 洗涤：充分的洗涤至关重要，可以去除未结合和非特异性结合的抗体/酶，是降低背景的关键步骤。但洗涤过程也要轻柔，避免细胞损失。
标签化反应
l 激活：确保Mg²⁺被准确加入以激活pA-Tn5酶。
l 时间与温度：反应时间（通常为1小时）和温度（37℃）需要精确控制。时间过长或温度过高可能导致过度标签化，产生过多的短片段，影响后续测序；时间过短则标签化不足，文库产量低。
l 终止：使用SDS终止反应并释放DNA片段时，要确保充分混匀和孵育时间，以彻底灭活酶活性。
DNA纯化与文库扩增
l 纯化：一般使用磁珠纯化，以有效去除蛋白质等杂质。
l PCR循环数：由于CUT&Tag文库产量通常很高，应使用尽可能少的PCR循环数（通常12-15 cycles）来避免引入扩增偏倚和重复序列。建议先进行qPCR预实验来确定最佳循环数。
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